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AbCys le propone una amplia gama de medios de separación adaptados a sus investigaciones. Para cada aplicación le podremos proporcionar un protocolo y medio apropiado.  Medios de separación de linfocitos y monocitos.Medio de separación de monocitos.Medio de separación de linfocitos y monocitos animales. Medios de separación de polinucleares.Medios de separación universales con densidad modulable permitiendo separar las diferentes fracciones celulares, los virus, los espermatozoides, los Islotes de Langerhans...
La centrifugación de sangre diluida sobre un medio de cultivo constituido por polisucrosa-metrizoato de sodio es el método de calidad para la separación de linfocitos. El éxito de este método, es decir, la recuperación de linfocitos viables con la proporción la más baja posible de granulocitos o eritrocitos contaminantes, depende en gran parte de la forma en la que la sangre se deposita sobre la polisucrosa, y del mantenimiento de una superficie de separación muy neta entre las dos fases, antes de la centrifugación. El tubo UNI-SEP se puso a punto para lograr fácilmente este objetivo. Permite transferir directamente la muestra de sangre en el tubo, sin ninguna precaución destinada a evitar la mezcla con la polisucrosa. Esto permite el tratamiento simultáneo de un gran número de muestras, sobre todo teniendo en cuenta que el mecanismo permite una reducción del tiempo de centrifugación necesario para la separación de los linfocitos. OBSERVACIONES TÉCNICAS Los UNI-SEP y UNI-SEPMAXI sont tubos para centrifugar con membrana plástica estéril que contienen en el fondo del tubo un medio de separación de linfocitos (5,6% de polisucrosa y 9,6% de metrizoato de sodio, densidad de 1,077 g/ml y osmolaridad de 280 mOsm). La sangre, transferida habitualmente sobre la membrana, no perturba la superficie de la capa de polisucrosa- metrizoato. Durante la centrifugación, la membrana se abre para permitir la mezcla polisucrosa-células sanguíneas. Los glóbulos rojos se agregan y los granulocitos sedimentan en el fondo, mientras que los glóbulos blancos migran hacia la superficie de separación del plasma y de la capa de polisucrosa. Así pues, pueden ser identificados inmediatamente puesto que aparecen formando un anillo blanco por encima de la membrana. MODO DE UTILIZACIÓN 1.Los tubos UNI-SEP y UNI-SEPMAXI son estériles y listo para el uso. Abrirlos en condiciones asépticas. 2.Los mejores resultados han sido obtenidos para separaciones entre 18º y 20ºC. 3.Utilizar una sangre desfibrinada o tratada con un anti coagulante, a diluir llegado el caso en un volumen igual a la solución salina estéril o en una solución isotónica. Añadir la sangre diluida o no diluida directamente en el tubo según las indicaciones de la tabla 1. Centrifugar durante 20 minutos a 1.000 g a una temperatura entre 18 y 20ºC. (Si la temperatura es inferior, hay que aumentar la temperatura de centrifugación).
Eritrocitos, células muertas y MNs (leucocitos polinucleares o granulocitos) migran hacia el fondo del tubo mientras que los linfocitos se encuentran por encima de la membrana, donde el gradiente de sucrosa es el más importante. 4. Extraer el plasma rico en plaquetas transfiriéndolo en otro tubo. Tomar la capa de linfocitos utilizando una pipeta o eliminando el contenido del tubo que se encuentra por encima de la membrana y centrifugar para recuperar el culote de linfocitos. NOTA En las condiciones de transporte normal, la polisucrosa-metrizoato se mantiene debajo de la membrana. Sin embargo, pueden ocurrir fugas en la parte superior del tubo. Centrifugarlo durante 1 minuto a 400 g para poner de nuevo la totalidad del líquido debajo de la membrana. ALMACENAMIENTO Almacenar en la caja entre +4 y +25ºC en la oscuridad. La deterioración de la polisucrosa-metrizoato se identifica por la aparición de un color amarillo o de partículas en solución.
SEPARACIÓN DE LINFOCITOS POR GRADIENTE DE DENSIDAD PARA LOS FLUIDOS BIOLÓGICOS CON BAJA PROPORCIÓN EN GLÓBULOS ROJOS La hematocrita, o proporción de los glóbulos rojos en la sangre, es el factor terminante del buen funcionamiento de los tubos de separación de linfocitos UNI-SEPTM. En efecto, durante la centrifugación, los glóbulos rojos y los polinucleares desplazan el polisucrosa-metrizoato de sodio por gradiente de densidad, permitiendo así recoger un anillo de linfocitos formado por encima de la membrana. De este modo, en el caso en el que los glóbulos rojos estén en cantidad insuficiente, el polisucrosa-metrizoato permanece en la membrana, y los linfocitos son difícilmente recuperables. Es el caso para las sangres totales diluidas, las fracciones enriquecidas de linfocitos, la toma de médula, o los líquidos linfáticos o espinales. Es entonces imprescindible utilizar el BUFFY-BOOSTER, líquido inerte y estéril de alta densidad, no miscible al agua. En efecto, la fuerza centrífuga arrastra el BUFFY-BOOSTER al fondo del tubo. Los glóbulos rojos se disponen entonces en una fina capa por encima del BUFFY-BOOSTER, sin interpenetración de fases. El polisucrosa-metrizoato y los linfocitos pueden migrar por encima de la membrana, sabiendo que el polisucrosa-metrizoato de sodio se desplaza hacia arriba de un volumen igual a la cantidad de BUFFY-BOOSTER y de glóbulos rojos introducida. Ninguna contaminación de linfocitos o de plasma diluido por los eritrocitos o por el BUFFY-BOOSTER es posible, puesto que los glóbulos rojos son retenidos por la membrana, bloqueando así el BUFFY-BOOSTER. MODO DE UTILIZACIÓN El BUFFY-BOOSTER es un líquido estéril listo para su uso, condicionado en botellas teñidas de 20 ml. La toma se realiza una pipeta o una jeringuilla. Tubos UNI-SEP: añadir 0,7 ml de BUFFY-BOOSTER para 3 ml de BUFFY Coat no diluido. Tubos UNI-SEPMAXI: añadir 3 ml de BUFFY-BOOSTER para 3 ml de BUFFY Coat no diluido. Añadir la muestra de sangre (la cantidad debe ajustarse en función de la muestra) y seguir las instrucciones. OBSERVACIONES TÉCNICAS La utilización de BUFFY-BOOSTER se preconiza cuando el volumen de las células precipitadas es inferior al 30% del volumen de polisucrosa-metrizoato presente en el tubo. Si el BUFFY-BOOSTER no se ha utilizado desde el principio, es posible añadirlo después de la primera centrifugación: añadir 3 ml o 0,7 ml de BUFFY-BOOSTER en función del tubo utilizado y centrifugar 5 minutos a 1.000 g. La capa de linfocitos aparecerá entonces varios milímetros por encima de la membrana. ALMACENAMIENTO Almacenar entre +4 y +20ºC en la oscuridad. OPTIMIZACIÓN DE UTILIZACIÓN UTILIZACIÓN CON SANGRE
UTILIZACIÓN CON MÉDULA
NB: ¡No se preocupe! Si el anillo de linfocitos se encuentra debajo de la membrana del tubo, añada el BUFFY BOOSTER y centrifugue de nuevo. El anillo obtenido se encontrará entonces por encima de la membrana del tubo.
Columna en lana de nilón lista para su uso, para la preparación de fracciones enriquecidas en linfocitos T y linfocitos B a partir de preparación de linfocitos totales. Las técnicas que utilizan las columnas de nilón y que explotan la propiedad de las células B de adherir al nilón, al inverso de las células T, son técnicas elegidas por un gran número de laboratorios para obtener poblaciones enriquecidas en células B y T de manera simple y rápida. Este método, con referencias de más de 30 años, da un buen rendimiento para los linfocitos B y T, con una pureza de aproximadamente 90% y más. Las columnas UNI-SORB de Novamed son tubos de polipropileno con malla de nilón especialmente tratadas, esterilizadas y listas para su uso. La parte superior de la columna está cerrada por un tapón de caucho, que se puede perforar por una aguja de jeringuilla. Los mejores resultados se obtienen volcando el tubo e inyectando la preparación celular por el tapón. Tras la inoculación en posición horizontal, se mantiene la columna vertical y se controla la elución por un único grifo. Las columnas UNI-SORB son fabricadas según especificaciones rigurosas, garantizando resultados reproductibles y de una cualidad constante. PROCEDIMIENTO DE SEPARACIÓN 1. Quitar el tapón protector del grifo. 2. Sujetar la columna volcada y abrir el grifo. Levantar la tira de la cápsula metálica en la parte superior de la columna. 3. Inyectar lentamente a través del tapón de caucho rosa (debajo de la cápsula metálica), la cantidad suficiente de una solución al 5% de Suero Bovino Fetal en el PBS para cubrir enteramente la malla de nilón 1 x 10 ml. Volcar la columna para permitir al medio de cultivo en exceso fluirse y a las burbujas de aire evacuarse. 4. Preparar los linfocitos para la centrifugación por gradiente de densidad (referencia UNI-SEP con LYMPHOPREP) 5. Obtener una suspensión de 108 células en 2 ml de solución de Suero Bovino Fetal en el PBS. 6. Volcar la columna e inyectar lentamente la suspensión de células a través del tapón rosa, grifo abierto. 7. Cerrar el grifo y dejar incubar la columna durante 60 minutos a temperatura ambiente. 8. Quitar el tapón de aluminio y el tapón de caucho de la parte superior. 9. Abrir el grifo y colectar el eluyente. Lavar la malla de nilón con medio de cultivo (2 x 10 ml) para quitar totalmente las células no adherentes. 10. Para recoger las células B, llenar la columna con medio de cultivo (10 ml) y comprime la malla con el pistón (recomendamos el pistón de una jeringuilla de uso único de 5 ml de 13 mm de diámetro) 11. Centrifuga las células colectadas y retirar el sobrenadante. Resuspender el culote de células con 10 ml de medio de cultivo adecuado. |
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