Domaines d'activités
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Immunologie > Apoptose
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Vous avez des problèmes avec la méthode TUNEL ? Changez de méthode !
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Système de détection de l’Apoptose : anti-ADNsb/APOSTAIN, un produit AbCys
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I Principe de la méthode :
Le test présenté ici est basé sur la sensibilité accrue de l’ADN à la dénaturation thermique chez les cellules apoptotiques. Cette méthode permet la dénaturation de l’ADN par chauffage à 56 °C en présence de formamide, et son marquage par l'anticorps monoclonal (Mab F7-26) spécifique de l'ADN simple-brin (ADNsb).
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II Avantage de la méthode :
1. Les cellules nécrosées possédant un haut niveau de fragmentation d'ADN doubles-brins, sont mises en évidence par la méthode TUNEL, mais ne réagissent pas avec l’anticorps monoclonal anti-ADNsb.
2. Quelque soit le niveau de fragmentation de l’ADN des cellules apoptotiques, l’intensité de la révélation obtenue par la technique Formamide-Mab est similaire.
3. Mab F7-26 n'est pas spécifique d'une espèce et peut être utilisé pour détecter les cellules apoptotiques chez diverses espèces (la souris, le rat, l’homme...).
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| Code |
Dénomination |
Clone |
Type |
Condi. |
Inf. |
Fiche |
Prix |
Devis |
| AbC156 |
ADN ss (APOSTAIN)
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F7-26 |
Mc |
100 µg |
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III Les Applications
A - Microscopie à Fluorescence
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| A Fluorochrome à ADN (DAPI) |
B Mab pour l’ADNsb |
Les microphotographies (A) et (B) représentent la fluorescence des cellules MB-MDA-468 traitées avec la staurosporine (inhibiteur de protéine kinase), chauffées ensuite dans le formamide, et marquées avec le Mab F7-26. Un contre-marquage avec le fluorochrome à ADN DAPI a été effectué. Le même champ est obtenu par le DAPI (photo A) et par le marquage anticorps-fluoresceine (photos B). Seules les 3 cellules apoptotiques possédant une chromatine condensée à la périphérie (phénomène caractéristique de l’apoptose) sont marquées avec le Mab. Agrandissement, x1000
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B - Cytométrie en flux
a. Mab pour ADNsb
La figure a. représente les distributions de la fluorescence par cytométrie en flux des cellules MB-MDA-468 chauffées en présence de formamide et marquées avec le Mab F7-26. L’apoptose a été induite par la staurosporine et la nécrose par l’azide de sodium ou l’hyperthermie. Les profils de fluorescence obtenus pour les cellules apoptotiques sont d’une intensité supérieure aux profils de fluorescence des cellules nécrosées et des cellules témoins.
b. TUNEL
La figure b. représente les distributions de fluorescence par cytométrie en flux des cellules MB-MDA-468 marquées par la méthode TUNEL. L’apoptose est induite par la staurosporine et la nécrose par l’azide de sodium ou l’hyperthermie. Les cellules apoptotiques et les cellules nécrosées sont marquées, la méthode TUNEL ne permet donc pas de différencier le phénomène apoptotique de la nécrose cellulaire.
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C - Détéction de l’apoptose sur coupes de tissus
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| A Hydrocortisone |
B Témoin |
Les Photomicrographies représentent les thymus d'une souris traitée par l’hydrocortisone (A) et non traitée (B). Les coupes de tissus fixés dans le formol sont chauffées dans le formamide, marquées avec le Mab F7-26 et contremarquées avec l’hématoxyline. Les colorations brunes proviennent des noyaux de cellules apoptotiques à chromatine condensée révélée par l’anticorps.
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| C Hydroxyurée |
D Témoin |
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AbCys propose l'Annexine V recombinante humaine dans des kits qui contiennent le tampon de marquage et l'iodure de propidium. Ces kits simples et faciles d'utilisation sont d'exellents outils pour la détection et la quantification de cellules apoptotiques par la cytométrie en flux.
Les kits Annexin V sont disponibles avec différents conjugués (FITC, Biotine, PE et APC) et dans différents formats (de 20 à 300 tests).
Les photos A, B, C représentent des thymocytes traités par l'étoposide et mis en évidences par un double marquage supravital incluant l'Annexine V couplée au FITC et l'iodure de propidium.
La photo A représente un stade apoptotique précoce. Les thymocytes sont marqués positivement par l'Annexine V mais restent négatifs pour l'iodure de propidium, bien que des noyaux fluorescents apparaissent progressivement avec la dégradation de la membrane plasmique.
Les photos B et C représentent un stade apoptotique tardif. Les cellules sont positives pour le marquage à l'iodure de propidium et la présence de vésicules marquées par l'Annexine V est observé à la surface de ces cellules.
(Photo B et C: x40; photo A: x100)
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| Code |
Dénomination |
Clone |
Type |
Condi. |
Inf. |
Fiche |
Prix |
Devis |
| AbC306-a |
Annexine V
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Ag |
30 µg |
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| AbC306FI |
Annexine V FITC Kit 300 tests (Kit: tampon de marquage et iodure de propidium)
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Ag |
Kit 300 tests |
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| AbC306FI-100T |
Annexine V FITC 100 tests ((Kit: tampon de marquage et iodure de propidium)
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Ag |
Kit 100 tests |
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| AbC306FI-c |
Annexine V FITC 20 tests (Kit: tampon de marquage et iodure de propidium)
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Kit |
20 tests |
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| AbC306BT |
Annexine V BIOTINE Kit 300 tests (Kit)
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Ag |
Kit 300 tests |
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| AbC306BT-100T |
Annexine V BIOTINE 100 tests (Kit)
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Ag |
Kit 100 tests |
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| AbC306BT-a |
Annexine V BIOTINE 20 tests
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Ag |
100 µl pour 20 tests |
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| AbC306BT-c |
Annexine V BIOTINE 20 tests (Kit)
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Ag |
Kit 20 tests |
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| AbC306PE |
Annexine V R-PE 100 tests
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Ag |
500 µl pour 100 tests |
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| AbC306PE-a |
Annexine V R-PE 20 tests
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Ag |
100 µl pour 20 tests |
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| AbC306APC |
Annexine V APC 100 tests
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Ag |
500 µl pour 100 tests |
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| AbC306APC-a |
Annexine V APC 20 tests
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Ag |
100 µl pour 20 tests |
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Les Superoxides Dismutases (SODs) sont une famille de métalloprotéines uniques qui catalyse la transformation de radicaux anioniques superoxyde (O2-) en oxygène (O2) et peroxyde d'hydrogène (H2O2)
O2- + O2- + 2H+ => H2O2 + O2
Les étapes tardives de l'apoptose sont caractérisées par la perte de l'intégrité membranaire et la libération de la Cu/ZnSOD.
Ainsi les cellules apoptotiques en phase tardive peuvent être quantifiées en utilisant le dosage ELISA Cu/ZnSOD
Le taux de Cu/ZnSOD est un paramètre valable pour la quantification des cellules apoptotiques car :
AbCys propose l'Annexine V recombinante humaine dans des kits qui contiennent le tampon de marquage et l'iodure de propidium. Ces kits simples et faciles d'utilisation sont d'exellents outils pour la détection et la quantification de cellules apoptotiques par la cytométrie en flux.
Les kits Annexin V sont disponibles avec différents conjugués (FITC, Biotine, PE et APC) et dans différents formats (de 20 à 300 tests).
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 la Cu/ZnSOD est présent dans tous les types cellulaires
la Cu/ZnSOD n'est pas induit par les cytokines durant l'activation cellulaire
la gamme de concentration de Cu/ZnSOD est très limitée dans les différents types cellulaires : 14,9±1,2 dans les érythrocytes, 11±1,4 dans les granulocytes, 25,5±3,5 dans les monocytes, 52,3±8,8 ng/l dans les lymphocytes
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La libération de Cu/ZnSOD dans le surnageant peut être mesurée avec l'ELISA Cu/ZnSOD (AbC222). Cette méthode a les avantages suivants :
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elle est non radioactive,
facile d'utilisation,
des temps d'essai extrêmement courts,
le marquage des cellules n'est pas nécessaire. Les cellules post-mitotiques peuvent aussi être quantifiées.
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Cu/ZnSOD ELISA(Existe en version Module Set AbC222MST)
Pour la recherche uniquement
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Tests : 96/40*
Gamme : 5 - 0,08 ng/ml
Sensibilité : 0,07 ng/ml
Précision intra-essai (C.V.) : 5.1%
Précision inter-essai (C.V.) : 5.8%
Rendement : 98%
Volume d'échantillon : 10 µl (1:20 pré dilué)
Temps : 75 min
Enzyme Conjugué : HRP
Substrat : TMB
Applications : Néphropathies (4), trisomie 21(5, 2), inflammations chroniques (1).
Stockage : 2-8°C
Conditions de transport : 2-8°C
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Références :
1) Goebel K. M., and U. Storck. (1983). Effect of intra-articular orgotein versus a corticosteroid on rheumatoid arthritis of knees. Am. J. Med. 74, 124-28.
2) Holzgreve W., P. Miny, and S. Tercanti. (1991). Prenatal interventions for diagnosis and therapy in risk pregnancies. Diagnose Labor 41, 162-178.
3) J y S. R. W. S. Kane, M. B. Bailie, G. D. Abrams, and B. R. Lucchesi. (1984). Canine myocardial reperfusion injury. Its reduction by the combined administration of superoxide dismutase and catalase. Circ. Res. 54, 277-285.
4) Porstmann T., R. Wietschke, S. Jahn, R. Grunow, H. Schmechter, B. Porstmann, S. Kießing, M. Bergande, R. Blieber, and R. von Baehr. (1989). Aufbau eines superschnellen Enzym Immunoassays für humane Cu/Zn Superoxid-Dismutase mit monoklonalen Antikörpern und Beispiele für seine klinische Anwendung. Monoklonale Antikörper, Springer Verlag Wien, ew York. Ed.: R. von Baehr, H. P. Ferber, T. Porstmann.
5) Porstmann T., R. Wietschke, G. Cobet, K. Lorenz, R. Grunow, S. Jahn, R. Bollmann, G. Stamminger, and R. von Baehr. (1990). Immunochemical quantification of Cu/Zn superoxide dismutase in prenatal diagnosis of Down's Syndrome. Hum. Genet. 85, 362-366.
* nombre des micropuits/échantillons qui peuvent être déterminés en deux exemplaires
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| Code |
Dénomination |
Clone |
Type |
Condi. |
Inf. |
Fiche |
Prix |
Devis |
| AbC222 |
Cu/ZnSOD ELISA Kit
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Kit |
1 x 96 puits |
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Gamme AbC
Une grande idée se reconnaît à ceci qu’elle ne cesse de se perfectionner.
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Quantitate caspase-mediated apoptosis in whole living
cells without using antibodies
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| Code |
Dénomination |
Clone |
Type |
Condi. |
Inf. |
Fiche |
Prix |
Devis |
| 91 |
FAM FLICATM Poly Caspases Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
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| 92 |
FAM FLICATM Poly Caspases Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
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| 97 |
FAM FLICATM Caspase 1 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
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| 98 |
FAM FLICATM Caspase 1 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
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| 918 |
FAM FLICATM Caspase 2 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
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| 919 |
FAM FLICATM Caspase 2 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
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| 93 |
FAM FLICATM Caspases 3 & 7 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
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| 94 |
FAM FLICATM Caspases 3 & 7 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
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| 95 |
FAM FLICATM Caspase 6 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
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| 96 |
FAM FLICA Caspase 6 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
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|
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| 99 |
FAM FLICATM Caspase 8 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
|
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|
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| 910 |
FAM FLICATM Caspase 8 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
|
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| 912 |
FAM FLICATM Caspase 9 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
|
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|
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| 913 |
FAM FLICATM Caspase 9 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
|
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| 922 |
FAM FLICATM Caspase 10 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
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| 923 |
FAM FLICATM Caspase 10 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
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| 929 |
FAM FLICATM Caspase 13 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
25 tests |
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| 930 |
FAM FLICATM Caspase 13 Assay Kit (green fluorescent inhibitors)
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Kit |
100 tests |
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ICT’s Protease Kits :
• Are easy Just add the reagent directly to the cell culture and incubate.
• Are fast The reactions start within 15 minutes of addition to the cells, however we recommend an incubation of 1-4 hours.
• Do not kill the cells The reagents may be incubated up to 72 hours without killing the cells.
• Are brighter Carboxyfluorescein generates a brighter signal than FITC.
• Get into cells better Our reagents are nonpolar, so they pass right thru the cell membrane.
• Use whole living cells You can study apoptosis as it occurs in the cell.
• No lysis or permeabilization steps required You don’t have to destroy the cell to study it.
• Generate better data There is no interference from pro-caspases or inactive forms of the enzyme.
• Do not use antibodies They use substrate and inhibitor peptide sequences linked to a fluorescent label.
• Are more reliable Only cells with active enzymes fluoresce.
• Detect apoptosis earlier than Annexin V and TUNEL assays Caspases are released before the phospholipid turnover & DNA laddering.
• Are flexible Protocols can be customized to fit your experiment.
• Are qualitative and quantitative Read with a fluorescence plate reader, fluorescence microscope, or flow cytometer.
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Figure 2. Jurkat cells dually stained with Hoechst and FAM-VADFMK.
Caspase activity is revealed by green fluorescence in cell #2, indicating that only this cell is apoptotic.
Cell #1 is also dying (scattered blue), but is not apoptotic because it is not green.
Cell #3 is healthy (concentrated blue nucleus).
ICT’s FLICA™ kits measure active caspases 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 13, or all of them at once.
The FLICA™ reagents (Fluorescent Labeled Inhibitors of Caspases) are comprised of 3 segments - they include: a red (SR = sulforhodamine) or green (FAM = carboxyfluorescein) fluorescent label; an amino acid peptide inhibitor sequence targeted by the active caspase, such as LETD (which is targeted by caspase 8); and a fluoromethylketone group (FMK) which acts as a leaving group and forms a covalent bond with the active enzyme.
The FLICA™reagents are cell permeant, so you don’t have to lyse or permeabilize the membrane to get it into the cell.
Just culture your cells, add the FLICA™ probe to the media, incubate, and wash the cells.
If there are active caspases, they will bind to FLICA™ and retain it within the cell, thereby capturing the fluorescent signal.
The FAM and SR FLICA™ probes constantly fluoresce, therefore any unbound reagent must be washed back out of the cell to remove any background noise. This is done by several quick rinse and spin steps, or further incubation with the wash buffer or media.
The resulting positive fluorescent signal can be detected with a fluorescence microscope (Figures 2, 3, 5, 7, & 9), a fluorescence plate reader (Figure 10), or a
flow cytometer (Figures 1 & 7). The green FLICA™ probe, FAM, excites at 490nm and emits at 520nm. The red FLICA™ probe, SR, excites at 560nm and emits at 600nm.
You can detect caspase activity in individual cells or culture them up to 1x106 cells/mL.
They also work with adherent cells (Figure 3). FLICA™ kits have been used successfully with whole paramecuim, drosophila embryos, thin tissue sections, frozen sections, whole organs, and have even been injected intravenously into small chickens and mice (please call us for details).
To detect apoptosis in general, use the green or red poly caspases kits. These kits use a general peptide sequence (VAD) which reacts with all active caspases. To target a specific caspase, ICT offers several green FAM-FLICA™ kits which react with different caspases (caspase 1, 2, 3&7, 6, 8, 9, 10, or 13) and red SR-FLICA™ kits which react with all caspases, 3&7, and caspase 9. Use the red and green kits together and with our serine protease and cholinesterase kits for duallabeling studies (Figures 7 and 9).
See a list of all green and red FLICA™ kits and pricing on page 14.
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Figure 3. After exposure to kainic acid over time, and labeling with SR-VAD-FMK (kit #916 and #917) for 1 hour, rat brain cortical cells in Figure 3 show increasing apoptosis.
Untreated control cells (3a) exhibit little caspase activity. In this experiment, cells were treated with kainic acid for 40 minutes (3b), 4 hours (3c), and 24 hours (3d) revealing increasing caspase activity and apoptosis.
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Votre contact :
Manuel SACHA (Product Manager)
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Quantitate apoptosis in animals with FLIVOTM
Researchers can now quantify apoptosis in living animals using AbCys's new FLIVO in vivo Fluorescence Apoptosis Detection Kits. Live animal models are invaluable tools for cellular research, particularly in tumor biology and proliferation studies. Unfortunately, the trauma of sacrificing an animal or excising tissue artificially increases the levels of apoptosis in experimental and control animals. This artifact can be eliminated by labeling apoptotic cells in vivo. You will get a true representation of the induction of apoptosis as a result of the treatment without measuring apoptosis resulting from the manipulation of tissues. FLIVO kits are based on FLICA™ reagents(Fluorescent Labeled Inhibitors of Caspases), which measure active caspases inside living cells. The first generation of these kits was successfully used to detect active caspases in whole living cells grown in culture, in whole drosophila embryos, in live paramecia, and even in yeast.
ICT has now optimized its FLIVO™reagents for injection into live animals.
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In vivo FLIVO
- Live animals - study apoptosis in whole mouse model systems.
- Easy - inject intravenously; no lysis or permeabilization steps.
- Fast - results in 30-60 minutes.
- Reliable - only cells with active caspases fluoresce.
- Specific - no interference from pro-caspases or inactive enzymes.
- Sensitive - detect very low levels of apoptosis.
- Accurate - labels only apoptotic cells; will not stain necrotic nor healthy tissues.
- Direct - active caspases are covalently bound to FLIVOTM.
- Safe - use fluorescent probes instead of radioisotopes.
- Quantitative - analyze animals with a fluorescence microscope, whole animal imaging system, fluorescence plate reader, or flow cytometer.
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Small Green FLIVO™ kits contain: FAM-FLIVO™ reagent (1 vial) and injection buffer. Cat.# 980, (enough for 6 rats or mice).
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| Code |
Dénomination |
Clone |
Type |
Condi. |
Inf. |
Fiche |
Prix |
Devis |
| 980 |
Green FLIVO™ In Vivo Apoptosis Detection Kits
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Kit |
6 souris |
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Large Green FLIVO™ kits contain: FAM-FLIVO™ reagent (4 vials) and injection buffer. Cat.# 981, (enough for 25 rats or mice).
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| Code |
Dénomination |
Clone |
Type |
Condi. |
Inf. |
Fiche |
Prix |
Devis |
| 981 |
Green FLIVO™ In Vivo Apoptosis Detection Kits
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Kit |
24 souris |
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Small Red FLIVO™ kits contain: SR-FLIVO™ reagent (1 vial) and injection buffer. Cat.# 982, (enough for 6 rats or mice).
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